日韩视频欧美视频_在线观看亚洲精品视频_久久青草久久_欧美成人第一页

蛋白質印跡（Western Blot, WB）又稱為免疫印跡（Immunoblot），是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將樣品中分子量大小不同的蛋白分開，然后通過電轉移的方法將凝膠中的蛋白定量地遷移并幾乎原位復制、固定到固相膜上，再利用抗原、抗體的特異性結合反應，特殊的抗體標記技術以及相應的檢測方法，進而對目的蛋白進行定性、相對定量檢測的技術。此項技術誕生于上世紀七十年代，近半個世紀以來經久不衰。
WB實驗流程分為樣本采集，蛋白樣品制備，上樣，凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，顯色（信號檢測）。作為一名實驗汪是不是近又被折磨到體無完膚？今天來和大家聊聊應用廣泛幾乎人人都曾中槍的Western Blot實驗—樣本采集和蛋白制備的相關知識和技巧。

一、樣本采集和保存
1. 對于動物組織和植物器官，樣本較多或取樣時間間隔太長則需先將樣本放入液氮速凍冷存；若未能及時進行蛋白樣品制備，可液氮速凍后，存入-80℃保存約六個月或浸入液氮罐保存約一年。
2. 對于細胞和一些微生物樣本，可去除培養基后，加裂解液制備蛋白樣品；若未能及時制備蛋白樣品，去除培養基后，將其液氮速凍后保存于-80℃（約一個月）或保存于液氮（約三個月）。
3. 所有樣本均不建議保存于-20℃。-20℃時，組織、細胞內的水會結晶，細胞活性和組織微觀結構會受到傷害，生物大分子受到組織、細胞內多種因素的影響，穩定性可能會降低。

二、蛋白提取
一般為了提取到足夠的蛋白以及更容易地提取蛋白，需要準備足夠量的樣本，要求樣本量為細胞>106個，組織>30mg，菌體濕重>10mg，植物>100mg，血清>50µL。蛋白提取的原則：低溫快速，裂解充分。
下面對一些常用樣本的蛋白提取過程進行簡單描述：
1. 細胞樣本
一般樣本為1×106～1×107個細胞，根據細胞量多少或不同細胞中蛋白含量的多少所加裂解液的量也不相同，一般1×106個細胞，加裂解緩沖液100~200µL，具體實驗操作時參照以上比例，可進行適當調整。
1) 懸浮細胞：收集培養皿或培養瓶中的細胞，4℃條件下1000~3000rpm，離心3~5min，留下細胞沉淀，去除細胞培養基，然后用預冷的0.01M PBS（即1×PBS）輕洗2次，4℃條件下1000~3000rpm，離心3~5min，去除上清，取用細胞沉淀，按照上述參考比例加入適量裂解緩沖液，吹打混勻，冰上裂解15~30min。
2) 貼壁細胞：直接去除培養皿或培養瓶中的培養基，用預冷的1×PBS輕洗2次，去除PBS，加入適量裂解緩沖，用細胞刮刮下細胞，連同裂解緩沖液一起收集，吹打混勻，冰上裂解15~30min。或者還有一種方法是直接用細胞刮刮下細胞，連同培養基一起收集，后續過程同懸浮細胞；再有一種方法，是用胰酶消化細胞后，收集細胞，離心沉淀，用預冷的PBS輕洗細胞沉淀，后續過程同懸浮細胞，但胰（蛋白）酶消化的方法不適用于目的蛋白為細胞膜上的膜蛋白，會造成影響。
2. 組織樣本
一般動物組織樣本，按照1mg組織加入10µL裂解液的比例進行添加，不同的組織蛋白含量也不同，需要調整添加量。去除組織樣本上的脂肪（可用預冷的眼科剪、鑷子去除）、血液（用預冷的PBS清洗）等雜質，防止造成污染，產生干擾。然后對處理好的樣本，加入裂解緩沖液，用預冷的眼科剪在冰上將其剪碎，可以加入鋼珠后，高速振蕩研磨儀進行破碎。對于骨、肌肉、皮膚、尾巴、韌帶組織等或硬度大或韌性強的樣本，可以先試著剪碎，再進行液氮研磨后加入適量裂解液。組織樣本處理后，冰上放置15~30min。
3. 冰上放置裂解的同時，需要加入適量蛋白酶抑制劑來減少蛋白酶的水解作用，磷酸化蛋白的提取還需要加入蛋白磷酸酶抑制劑。
4. 冰上放置裂解后，建議再進行超聲處理，經過超聲處理，裂解更充分。
5. 如有特殊的樣本或者特殊的目的蛋白，常規方法難以提取，建議查閱相關文獻，參照文獻上的配方和步驟提取；若后未找到相關資料，可購買商品化的試劑盒。