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流式細(xì)胞術(shù)作為一項生命科學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù)，想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用幾次之后，還是會有云里霧里的感覺。真正想掌握好一門技術(shù)，還是得從基礎(chǔ)部分就做好。話不多說，直接上干貨！

1 如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記？

流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個因素決定：流式細(xì)胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測多少個指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記。流式細(xì)胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時檢測的表面/胞內(nèi)/核內(nèi)蛋白就越多。

以Calibur為例說明：Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC；Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素，但是我們搭配的時候只能選擇其中1個。

如果流式細(xì)胞儀能做4個通道，在第1個原則之下，那么每個通道隨便選出1個熒光素就可以組合成4個顏色。以2根激光的Calibur為例，如常用的搭配是FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個搭配組合可以更改成Alex Fluro488(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+AlexFluro647(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE- Cy5（FL3）+APC(FL4)等多種組合。總之，在第原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，容易導(dǎo)致補償度，因此，通常我們不會將這兩種熒光素一起使用，即使他們不在同一通道檢測。

流式細(xì)胞儀有哪些激光

比如，標(biāo)配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個熒光通道/三個顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡稱)配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測FL1-FL4四個通道/4個顏色。不同型號的流式細(xì)胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力不一樣比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5,PE-Cy7,而FACSAria的第3 通道只能檢測PE-Texas Red,PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測。Calibur和LSR都能檢測4個顏色，但是第4個通道檢測的熒光素是不一樣的。

3 如果檢測的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？

如果需要做5個指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個通道，首先將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，可以將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具體的歸類方式可根據(jù)課題的設(shè)計來進行。

4 流式檢測樣本如何保存？

全血樣本：一般來說，血液樣本必須在6個小時內(nèi)處理，晚不得超過12小時；做完染色后，需要放在多聚甲醛中保存，一般可以存放3天左右。培養(yǎng)細(xì)胞樣本：培養(yǎng)的細(xì)胞可以用多聚甲醛保存。做DNA倍體的樣本：將樣本保存在70%的乙醇中，并適量加入血清，-70℃冰箱保存，可以幾個月內(nèi)檢測。

5 抗體染色的細(xì)胞不能立即檢測該如何處理？

如果實驗對細(xì)胞活性要求比較高，如凋亡實驗，必須盡快檢測；

如果實驗對細(xì)胞活性要求不高，可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘，固定后的細(xì)胞4℃過夜保存，次日檢測。

6 同型對照的作用是什么？

抗體有時會和非抗原結(jié)合，可能會因為非特異的蛋白-蛋白相互作用結(jié)合細(xì)胞內(nèi)成分，因為疏水作用結(jié)合脂肪，也可能會結(jié)合一些細(xì)胞表面表達的抗體受體。比如，IgG亞型的抗體會結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體，如CD16、CD32和CD64。理想條件下，各種類型的非特異性結(jié)合都可以通過蛋白（BSA、牛奶或動物血清）來阻斷。Fc受體的結(jié)合則可以通過與含免疫球蛋白的血清預(yù)孵育來阻斷。一個抗體非特異性相互作用和受體結(jié)合的情況，可以用無關(guān)抗原的相同亞型抗體來比照。

7什么時候需要使用同型對照？

做胞內(nèi)流式實驗：比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號蛋白等。

表面標(biāo)志特異性不高或者不常見的： 一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對照可排除假陽性； 因為不熟悉不常見標(biāo)志的表達情況，根據(jù)同型對照可以判斷陽性細(xì)胞的位置。對流式非常熟悉，且檢測的是CD3、CD4、CD19等表達強度非常高的標(biāo)志，可以不使用同型對照。

8怎樣選擇同型對照？

一般選擇與一抗的成分相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體：

比如抗人的CD56 FITC標(biāo)記的抗體，亞型是Mouse IgG1,κ，那么它的同型對照應(yīng)該是FITC標(biāo)記的Mouse IgG1,κ。

如果是抗體的組合形式，純化的一抗＋熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對照：

比如CD86的純化抗體，亞型是Mouse IgG1,κ，二抗是PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1，那么它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ。染色方式如下：樣本管，純化的CD86＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1(二抗)＋樣本；同型對照管，純化的同型對照＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1(二抗)＋樣本。如果沒有找到適合的同型對照，在保持來源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，優(yōu)先選擇的順序是亞鏈不同--亞型不同--相同類別,比如，某抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里找不到相同的同型對照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記Mouse IgG2а為同型對照；如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對照；如果后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對照。

9為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高？

首先需要檢查同型對照是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標(biāo)志在流式細(xì)胞術(shù)的表面或者胞內(nèi)表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對照時，同型對照非特異性的結(jié)合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現(xiàn)象。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。