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  免疫組織化學(xué)方法
 
 （一）酶標(biāo)記抗體組化法

   酶標(biāo)抗體組化技術(shù)是一種綜合定性、定位和定量，將形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測技術(shù)。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關(guān)系，確認(rèn)受染細(xì)胞類型，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和病理過程。 

1、基本原理

   酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性的單克隆抗體，是特異性強(qiáng)的價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在*抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。目前通常選用免疫酶組織化學(xué)間接染色法。

（1）標(biāo)本的制備和處理

   用于酶標(biāo)抗體組化技術(shù)的標(biāo)本有組織切片（冷凍切片和石蠟切片）、組織壓印片。標(biāo)本的制作和固定與熒光抗體技術(shù)相同，但尚需要一些特殊處理。 

（2）標(biāo)記酶

用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點：

① 酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于在光鏡或電鏡下觀察。

② 所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位。

③ 較易獲得的酶分子，有商品出售。

④ 中性 pH 時，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存 1-2 年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好。

⑤ 酶標(biāo)過程中，酶與抗體連接，不能影響二者的活性。

⑥ 被檢測組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。 

   其中 ① 、② 兩點zui重要，因為容易顯示的酶并非均能形成不可溶性的復(fù)合物。一般認(rèn)為，辣根過氧化物酶（HRP）較佳，是zui常用的一種酶。 

除 HRP 外，堿性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（GOD）也較常用。

（3）底物顯色劑

① DAB （3，3-二氨基聯(lián)苯胺）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。

② AEC （3，氨基-9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色。

2、以 PRRSV 為例介紹一下染色程序。

（1）切片準(zhǔn)備：將低溫保存的切片37 ℃預(yù)熱 5分鐘 。

（2）常規(guī)脫蠟： 二甲苯15分鐘；100% 乙醇 5分鐘；100%乙醇1分鐘；90% 乙醇 1分鐘；75% 乙醇 1分鐘。

（3）抑制內(nèi)源酶：1% 鹽酸酒精（75% 乙醇 99mL 加 1mL 鹽酸）作用10分鐘； 3%過氧化氫水溶液作用15分鐘。

（4）蒸餾水洗 2 次。 

（5）用 0.05% 胰酶37 ℃消化2分鐘。 

（6）PBS洗2次，擦干周圍后用組化（蠟）筆沿切片周邊畫一個圈 。 

（7）封閉：正常馬血清1：20倍稀釋， 37 ℃ 孵育20分鐘。

（8）加一抗（1 : 800倍稀釋的PRRSV單克隆抗體 Mab 11），37 ℃孵育1小時或37 ℃孵育0.5小時后4 ℃過夜。對照片不加一抗。 

（9）PBS 洗 3 次。

（10）加二抗（HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀釋）37 ℃孵育1小時。 

（11）PBS洗3 次。 

（12）加AEC顯色5~10分鐘。 

（13）蘇木素襯染10秒鐘。

（14）自來水洗2分鐘。

（15）待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片。

（16）鏡檢、觀察記錄結(jié)果。

（二）葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫檢測技術(shù) 

   葡萄球菌蛋白A（SPA）是一種從金葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它的一些免疫學(xué)特性，使其成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具。葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫檢測技術(shù)是根據(jù)它能與多種動物IgG的Fc 端結(jié)合的原理，用SPA標(biāo)記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測實驗。 

1、基本原理 

   SPA 具有和人及多種動物如豚鼠、兔、豬、犬、小鼠、猴等 IgG 結(jié)合的能力，可解決不同動物檢測時，需分別標(biāo)記相對應(yīng)的二抗的問題。 SPA結(jié)合部位是Fc段，這種結(jié)合不會影響抗體的活性。 SPA具有的結(jié)合力是雙價的，每個SPA分子可以同時結(jié)合兩個IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。但需注意的是SPA 對 IgG 免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性，如SPA與人IgG亞型：IgG 1、IgG 2和IgG 4有結(jié)合力，不結(jié)合IgG 3。只結(jié)合IgA 2 ，而不結(jié)合 IgA 1。SPA與禽類血清IgG不結(jié)合。因此應(yīng)注意可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。SPA 常用 HRP 標(biāo)記，可應(yīng)用于間接法。

2、染色程序

染色程序基本同酶標(biāo)抗體法，僅二抗改用 SPA-HRP。

（三） 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定 

1、對照的設(shè)立

  設(shè)立對照的目的在于證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對*抗體對照，常用的對照有陽性對照、陰性對照。 

（1）陽性對照是用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對照切片應(yīng)呈陽性結(jié)果。證明整個染色程序符合要求，尤其當(dāng)待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時，陽性對照就更加重要。 

（2）陰性對照是用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，另外空白、替代、吸收和抑制試驗均為陰性對照。當(dāng)陰性對照成立時，才能判定檢測結(jié)果，主要用于排除假陽性。